TÉCNICAS PARA LA OBTENCIÓN DE MUESTRAS
EN PARAFINA
Las muestras obtenidas utilizando la inclusión en parafina se obtuvieron del siguiente modo:
El primer paso es la perfusión de la rata.
La perfusión consiste en sustituir el riego sanguíneo por un medio sintético o "medio de perfusión" cuya composición, flujo, temperatura y presión sean las que tendría el flujo sanguíneo en el animal intacto.
En nuestro caso la perfusión se llevó a cabo del siguiente modo:
Se anestesió la rata con éter que es un anestésico que proporciona una excelente analgesia y relajación muscular.
Tras abrir la rata por la región abdominal aplicamos directamente en el ventrículo izquierdo Heparina como anticoagulante que facilite la salida de la sangre del animal.
Posteriormente procedemos al lavado de los órganos que se realiza utilizando NaCl 9%.
Para ello introducimos la cánula en el ventrículo izquierdo y la dirigimos hacia la aorta. Una vez que el NaCl ha empezado a entrar se corta la aurícula derecha de manera que mientras que la sangre sale ésta va siendo reemplazada por nuestro NaCl. Debemos dejar que penetre alrededor de 0.5 litros del NaCl.
Tras el lavado se procede a la sustitución del NaCl por el medio de perfusión que en este caso fue Complucad Muñiz dejando que penetre al menos 0.5 l.
Posteriormente se llevó a cabo la extracción de los órganos correspondientes.
Postfijación de las muestras en Complucad Muñiz durante 2 horas
La inclusión se realizó del siguiente modo:
Se seleccionaron los tejidos en piezas de alrededor de 1 cm3.
Se procede a la deshidratación del siguiente modo:
- Tres baños de 15 minutos con alcohol de 70º
- Tres baños de 15 minutos con alcohol de 96º
- Tres baños de 20 minutos con alcohol de 100º
- Un baño de 1 minuto con tolueno.
- Un segundo baño con tolueno de 5 minutos.
- Un baño de una hora con parafina recuperada
- Un baño de una hora con parafina nueva tras lo cual ya pueden confeccionarse los bloques.
Los cortes fueron realizados con un grosor de 10 micrometros.
Fueron utilizados dos métodos diferentes de tinción que son Hematoxilina/Eosina y Tricrómico siguiendo los siguientes protocolos:
HEMATOXILINA/EOSINA
Desparafinado con Histolemon.
Alcohol 100º: 2 baños de 10 minutos.
Alcohol 96º: 2 baños de 10 minutos.
Baño de agua: 1 baño de 10 minutos.
Hematoxilina: 15 minutos.
Baño de agua: 5 minutos.
Eosina: 25 segundos.
Abundante baño de agua.
Alcohol 96º:10 minutos.
Alcohol 100º: 10 minutos.
TRICRÓMICO
Desparafinar
Alcohol 100º: 2 baños de 10 minutos.
Alcohol 96º: 2 baños de 10 minutos.
Baño de agua: 10 minutos.
Azul aIcian: 30 minutos.
Lavar con agua.
Hematoxilina: 15 minutos.
Lavado abundante.
Picrocarmin: 2 minutos y medio.
Lavado rápido.
Alcohol 96º
Alcohol 100º
Por último las piezas se montaron con DePeX.
COMPLUCAD MUÑIZ. INMUNOQUÍMICA
Se realizó la perfusión de dos ratas Wistar. Con la primera se utilizó como medio de perfusión una mezcla que contenía el 10 % de la solución madre.
Con la segunda se utilizó como medio de perfusión una mezcla formada por un 7% del producto PB.
En la perfusión se utilizó como líquido de lavado NaCl, seguido del fijador correspondiente en cada caso, del que se introdujo aproximadamente medio litro.
De cada una de las ratas se extrajeron los siguientes órganos: hígado, pulmón, bazo, intestino, cerebro, músculo, corazón y riñón.
Tras la perfusión se procedió a la postfijación dejando los órganos en su producto de fijación usado en la perfusión. Los órganos se dejaron postfijando 2 h. Tras ello y sin ningún tipo de lavado se procedió a la inclusión en parafina. Se fragmentaron los órganos en piezas de un centímetro cúbico y se las aplicó tres lavados con alcohol de 70º de 20 minutos cada uno de ellos.
Posteriormente se deshidrataron del siguiente modo:
Se les aplicó tres baños con alcohol de 96º de 20 minutos cada uno.
Cuatro baños con alcohol de 100º de 20 minutos cada uno.
Luego se les aplicó un baño de 1minuto en tolueno seguido de otro de 5 minutos de duración.
Se metieron en un baño de parafina recuperada durante 1 hora seguido de otro baño de parafina nueva de 1hora 15 minutos. En ambos baños la parafina se mantuvo en una estufa a 50ºC.
Se confeccionaron los bloques.
Los cortes se realizaron de 10 micrometros de grosor todos ellos. Se dejaron durante al menos una noche en una estufa de 50ºC.
El desparafinado se realizó con xileno. Posteriormente se procedió a la hidratación siguiendo una línea decreciente en alcoholes desde el alcohol de 100º, de 96º hasta alcohol de 70º dejando cada uno de ellos tres baños de 10 minutos cada uno de ellos. Tras el último alcohol de lavó con PBS en dos baños de 20 minutos cada uno. Los siguientes pasos de la inmunohistoquimica fueron:
Se procedió a la inhibición de la peroxidasa endógena utilizando agua oxigenada al 3%.
Suero normal de rata para bloquear sitios inespecíficos
Aplicación del primer anticuerpo monoclonal específico. Los antisueros que se utilizaron fueron de cuatro tipos y se emplearon en los distintos tipos del siguiente modo:
En cerebro se uso Anti-laminina.
En pulmón se uso Anti-vimentina y Anti-citokeratinas.
En intestino se utilizó Anti-citokeratina
En hígado se utilizó Anti-vimentina
En músculo y en corazón se utilizó Anti-desmina.
En todos los casos el anticuerpo se mantuvo una hora a temperatura ambiente + toda la noche en nevera + una hora a temperatura ambiente.
Pasadas 24 horas se lavaron las muestras con PBS y se incubó con el segundo anticuerpo que es un Anti mouse Anti-IgG durante 3 horas. Se volvió a lavar con PBS y se incubó con PAP mouse durante otras 2 horas. Lavado con PBS se procedió a revelar la actividad peroxidasa utilizando diaminobenzidina (DAB) con la siguiente receta:
5 mgr. de DAB + 5 mls de PBS + 3 gotas de agua oxigenada.
Se incubó con esta solución durante 10 minutos.
Por último se procedió a su deshidratación con alcoholes crecientes de forma contraria al principio y se montaron los tejidos con DePeX.
