Para estudiar el efecto virucida de Complucad^Ò hemos diseñado varios experimentos dirigidos a conocer el efecto, en su caso, sobre los ácidos nucleicos que constituyen el genoma vírico o que permiten su estado de latencia en las células infectadas, ya que, si estos se afectasen, quedaría excluida cualquier posibilidad de transmisión. Sin embargo, hemos considerado necesario diseñar otra serie de experimentos para que, en el caso de que no se demostrase ningún efecto frente a los ácidos nucleicos, pudiese conocerse el efecto sobre la infectividad celular de los virus estudiados. Este conocimiento es necesario ya que, en condiciones naturales, no ocurre la infección a través del ácido nucleico vírico libre, sí no que es necesario que las envolturas del virus, es decir, algunas proteínas de la cápside en los virus desnudos, o algunas glicoproteinas en el caso de los virus cubiertos con membrana, interaccionen con los receptores de las células susceptibles a la infección (Figura 1). Sólo de esta forma ocurre la penetración del ácido nucleico, con o sin la cápside vírica, y puede comenzar el ciclo virico de replicación intracelular. Esas mismas glicoproteinas son las que pueden permitir la infección entre las células. Las células infectadas por los virus que generan glicoproteinas, de codificación virica, sobre la membrana celular y les permite interaccionar con los receptores de las células susceptibles provocando la transmisión intercelular de los virus (Figura 2).

Tanto para estudiar la acción de Complucad^Ò sobre los ácidos nucleicos de los virus, como sobre la infectividad de las células susceptibles, es necesario disponer de unos experimentos diseñados para evitar los resultados falsos negativos debidos a la acción del preparado sobre los sistemas de detección de los ácidos nucleicos o sobre las células susceptibles utilizadas para detectar los viriones viables, tras haber sido expuestos a la acción de Complucad^Ò . En este sentido era necesario conocer las concentraciones de Complucad^Ò toleradas por los enzimas que se utilizan en los procedimientos de detección los ácidos nucleicos viricos (transcriptasa reversa y DNA-polimerasa), así como sobre las células susceptibles utilizadas para detectar la presencia de viriones viables después de haber sido expuestos al preparado.

Efecto de Complucad^Ò sobre la viabilidad de células eucarióticas

Se ha determinado la acción de Complucad^Ò sobre dos tipos de células eucarióticas: células Vero desarrolladas en monocapa y células mononucleares de sangre periférica (PBMCs: Peripheral Blood Mononuclear Cells) desarrolladas en suspensión.

El efecto se ha determinado tras la exposición durante una hora de cultivos celulares a diluciones sucesivas de Complucad^Ò en base 10 (10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-6, 10^-7, 10^-8 y 10^-9). Las diluciones fueron realizadas en el mismo medio de cultivo utilizado para mantener las células, Medio Mínimo Esencial con sales de Earle para las células Vero y medio RPMI-1640 para las células PBMCs, ambos con suero bovino fetal al 10%. Tras la exposición y 48 horas de incubación a 37ºC en atmósfera de 5% de CO₂ las células fueron observadas mediante microscopio invertido (20X) para conocer su estado morfológico. A continuación las células fueron lavadas con tampón fosfato salino (PBS) y tenidas con azul tripano al 20 % para conocer su viabilidad (Figura 3).

Para determinar el efecto de Complucad^Ò sobre los ácidos nucleicos víricos hemos utilizado la amplificación de DNA vírico, de DNA provírico o de cDNA obtenido in vitro por el método de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR-directa: Direct-Polymerase Chain Reaction). Así mismo, la transcripción de RNA a cDNA con posterior amplificación del cDNA obtenido, cuando el genoma vírico es de RNA, a través del procedimiento de PCR-inversa (Reverse-PCR).

Para el procedimiento de transcripción inversa (Reverse-PCR) se ha utilizado un volumen final de 20 ml con 5 ml de RNA extraído en tampón de transcriptasa conteniendo DDT 0,1 M, 50 pmol de primer antisense, 0,25 mM de cada uno de los deoxinucleótidos trifosfatos (dNTPs), 10 U de RNAsina y 200 U de transcriptasa reversa MMLV.

Para el procedimiento de amplificación de DNA por PCR se ha utilizado un volumen final de 50 ml conteniendo KCI 50 mM, Tris HCL pH 8,3 10 mM, MgCl₂ 1,5 mM, gelatina 0,01%, 0,25 mM de cada deoxinucleótido trifosfato (dNTPs), 25 pmol de cada primer y 1 U de Taq-polimerasa.

Todas las reacciones se han realizado incluyendo simultáneamente un control positivo del ácido nucleico diluido a 10^-6 y sin exponer a Complucad^Ò (control de presencia de ácido nucleico amplificable), y un control positivo de reacción con Complucad^Ò diluido a 10^-6 para detectar en su caso la acción inhibidora de Complucad^Ò sobre los enzimas utilizados en la reacción de amplificación. Estos dos controles deben proporcionar un resultado positivo para dar validez a la reacción (Figura 4).

Para conocer el efecto de Complucad^Ò sobre RNA, cDNA y DNA provírico de se ha estudiado la secuencia genómica de la proteasa vírica con RNA extraído de viriones libres en plasma, sobre cDNA de VIH obtenido in vitro a partir de RNA, y sobre DNA provírico presente en células PBMCs infectadas cultivadas in vitro. Posteriormente, el ácido nucleico tratado y sin tratar, en el caso de los dos controles positivos, se ha diluido a 10^-6 para eludir, en su caso, el efecto de Complucad^Ò sobre la reacción de PCR directa o de la PCR-inversa (Figuras 5, 6 y 7). Las condiciones de transcripción y amplificación posterior han sido las descritas previamente, con la particularidad de que para la transcripción se ha utilizado una mezcla de hexámeros pd(N)₆ (Pharmacia Biotech). La secuencia genómica amplificada corresponde a la proteasa de VIH-1. Los productos de amplificación fueron detectados en un gel de agarosa al 3% tras tinción con bromuro de etidio.

El efecto de Complucad^Ò sobre RNA y cDNA de VHC se ha estudiado exponiendo plasma con VHC, RNA extraído de viriones libres en plasma y sobre cDNA de VHC obtenido in vitro a partir de RNA. Posteriormente, el ácido nucleico tratado y sin tratar, en el caso de los dos controles positivos, se ha diluido a 10^-6 para eludir, en su caso, el efecto de Complucad^Ò sobre la reacción de PCR directa o de la PCR inversa (Figuras 8 y 9). Se ha efectuado la transcripción y posterior amplificación de la región no-estructural NS5b. Para la transcripción se ha utilizado el primer antisense de Enomoto (1990) y dos amplificaciones sucesivas (nested) con los primers descritos por Enomoto (1990) y Simmons (1993), para la primera y segunda amplificación, respectivamente. Los tiempos y temperaturas de transcripción han sido: 5 min. a 20ºC, 5 min. a 25ºC, 5 min. a 30ºC, 5 min. a 35ºC, 30 min. a 42ºC y 4 min. a 94ºC. La primera amplificación se ha efectuado con 30 ciclos de 30 seg. a 94ºC, 30 seg. a 40ºC y 30 seg. a 72ºC. La segunda amplificación se ha efectuado a partir de 3 ml de [a primera amplificación con 25 ciclos de 30 seg. a 94ºC, 30 seg. a 45ºC y 1 min. a 72ºC. Los amplificados fueron detectados en un gel de agarosa al 3% tras tinción con bromuro de etidio.

El efecto de Complucad sobre DNA de VHS-1 se ha estudiado exponiendo sobrenadante de cultivos celulares conteniendo viriones de VHS-1. Posteriormente, el ácido nucleico tratado y sin tratar, en el caso de los dos controles positivos, se ha diluido a 10^-6 para eludir, en su caso, el efecto de Complucad^Ò sobre la reacción de PCR-directa. La región genómica amplificada pertenece a la glicoproteina gD (Figuras 10 y 11).

El efecto de Complucad^Ò sobre DNA de VHB se ha estudiado exponiendo plasma con virus de hepatitis B. Posteriormente, el ácido nucleico tratado y sin tratar, en el caso de los dos controles positivos, se ha diluido a 10^-6 para eludir, en su caso, el efecto de Complucad^Ò sobre la reacción de PCR directa (Figuras 12 y 13).

Para estudiar el efecto de Complucad^Ò al 4% durante 1 hora sobre la infectividad de viriones de Poliovirus tipo 1 se ha expuesto una suspensión titulada conteniendo 100.000 TCID₅₀ por ml. A continuación, tras diluir a 10^-4 para evitar el efecto tóxico de Complucad^Ò sobre las células Vero, se ha inoculado la mezcla de la suspensión de viriones tratada y diluida sobre monocapas de células Vero por triplicado. Tras incubación durante 48 horas a 37ºC en atmósfera de 5% de CO₂ se ha observado el efecto sobre la monocapa celular (Figura 14).

Para estudiar el efecto de Complucad^Ò al 4% durante 1 hora sobre la infectividad de viriones de VHS-1 se ha expuesto una suspensión titulada conteniendo 200.000 UFP por ml. A continuación, tras diluir a 10^-4 para evitar el efecto tóxico de Complucad^Ò sobre las células Vero, se ha inoculado la mezcla de la suspensión de viriones tratada y diluida sobre monocapas de células Vero por triplicado. Tras incubación durante 48 horas a 37ºC en atmósfera de 5% de CO₂ se ha observado el efecto sobre la monocapa celular (Figura 15 y 16).

Para estudiar el efecto de Complucad^Ò al 4% durante 1 hora sobre la infectividad de viriones de VIH-1 se ha expuesto una suspensión titulada conteniendo 1 x 10⁶ viriones por ml y una suspensión de células PBMCs infectada con VIH-1. A continuación, las células fueron lavadas para eliminar la presencia de Complucad^Ò y evitar el efecto tóxico sobre las células PBMCs y se ha inoculado la mezcla de la suspensión de viriones tratada y diluida a un cultivo de células PBMCs de donantes sanos estimulados con fitohemaglutinina (PHA) por triplicado. De igual forma, la suspensión celular tratada con Complucad^Ò se ha cocultivado con PMBCs estimulados con PHA. Tras 10 días de incubación a 37ºC en atmósfera de 5% de CO₂ se ha determinado la expresión de antígeno p24 en los sobrenadantes de los cultivos por un procedimiento inmunoenzimático (Cultek) (Figura 17 y 18).

Los cultivos de células Vero y de células blancas de sangre periférica (PBMCs) expuestos a Complucad^Ò sufren alteración cuando se exponen a concentraciones iguales o superiores a 10^-4 y 10^-6, respectivamente (Figura 3). Ello obliga a que cuando se efectúen estudios de infectividad celular con estas células las suspensiones de viriones tratados con Complucad^Ò al 4% deban diluirse antes de inocular las células, para que la concentración final del preparado en el cultivo celular no exceda de las concentraciones indicadas.

El tratamiento con Complucad^Ò sobre RNA extraído de viriones de VIH-1, cDNA obtenido in vitro, o DNA provírico intracelular, no se afecta, como se demuestra por la posibilidad de realizar las transcripciones o amplificaciones correspondientes mediante los métodos de PCR-inversa y PCR-directa (Figuras 5 , 6 y 7).

El tratamiento con Complucad^Ò sobre plasma conteniendo viriones VHC con RNA extraído de los viriones, o cDNA obtenido in vitro, no se afecta, como se demuestra por la posibilidad de realizar las transcripciones o amplificaciones correspondientes mediante los métodos de PCR-inversa (Figura 8 y 9).

El tratamiento con Complucad^Ò de plasma conteniendo viriones VHS-1 con DNA no afecta al DNA como se demuestra por la posibilidad de realizar la amplificación correspondiente mediante el métodos de PCR-directa (Figuras 10 y 11).

El tratamiento con Complucad^Ò de plasma conteniendo viriones VHB con DNA en plasma sanguíneo no afecta al DNA, como se demuestra por la posibilidad de realizar la amplificación correspondiente mediante el métodos de PCR-directa (Figura 12 y 13).

El tratamiento con Complucad^Ò de una suspensión con viriones de Poliovirus tipo 1 no afecta a la infectividad de este virus, como se demuestra por la posibilidad de infectar y obtener la replicación del virus en células susceptibles inoculadas con la suspensión tratada (Figura 14).

El tratamiento con Complucad^Ò de una suspensión con viriones de VHS-1 afecta a la infectividad de este virus, como se demuestra por la perdida de la capacidad infectiva, no pudiéndose conseguir la replicación del virus en las células susceptibles inoculadas con la suspensión tratada. Del mismo modo, tampoco se puede conseguir la infección con células Vero infectadas con VHS-1 y tratadas con Complucad^Ò al inocularlas en células Vero no infectadas. Los viriones intracelulares, que en el caso de VHS-1 pueden estar completamente formados, también se afectan como se demuestra al tratar las células infectadas y realizar su ruptura posterior antes de proceder a la inoculación de células no infectadas (Figuras 15 y 16).

El tratamiento con Complucad^Ò de una suspensión con viriones de VIH-1 afecta a la infectividad de este virus, como se demuestra por la perdida de la capacidad infectiva, no pudiéndose conseguir la replicación del virus en las células susceptibles inoculadas con la suspensión tratada. Del mismo modo, tampoco se puede conseguir la infección con células infectadas con VIH-1 y tratadas con Complucad^Ò al inocularlas en células PBMCs no infectadas. Los viriones intracelulares, que en el caso de VIH-1 están incompletos, no pueden, como era de esperar, infectar a células susceptibles como se demuestra al tratar células infectadas y realizar la ruptura posterior de las células antes de proceder a la inoculación de células no infectadas (Figuras 17, 18 y 19).

Teniendo en cuenta las consideraciones citadas, los experimentos diseñados han sido dirigidos a conocer si Complucad^Ò ejerce alguna acción sobre los ácidos nucleicos víricos (DNA o RNA) o sobre sus intermediarios de replicación (cDNA o DNA provírico). No obstante, por si las experiencias demostrasen que el preparado careciese de efecto sobre los ácidos nucleicos víricos, se diseñaron experimentos dirigidos a demostrar la inhibición de la infección utilizando dos modelos básicos de infectividad vírica: la de un virus desnudo (Poliovirus tipo 1) y la de un virus cubierto con glicoproteinas de interacción dispuestas en la membrana lipídica de envoltura (VIH-1). Por la trascendencia que podían tener los resultados con VIH-1 era necesario diseñar un modelo que corroborase los hallazgos con VIH-1 Este modelo ha sido VHS-1.

Los resultados obtenidos demuestran que Complucad^Ò respeta los componentes DNA, RNA, cDNA y DNA provírico. Esta acción aparentemente negativa podría ser beneficiosa si se demostrase que el producto tiene efecto sobre la infectividad vírica, ya que permitiría detectar la etiología de una infección vírica, cuando esta haya podido ser la causa del fallecimiento así como realizar los estudios genéticos humanos cuando estos fuesen necesarios.

1. Complucad^Ò al 4% durante 1 hora no lesiona el DNA vírico, DNA provírico, RNA vírico, ni el cDNA obtenido in vitro a partir de RNA. La ausencia de efecto sobre los ácidos nucleicos víricos carece de trascendencia en las infecciones víricas, ya que estas no se producen a través de la penetración del ácido nucleico libre, si no que requieren que el virión o la célula infectada, según los casos, contacten con la célula susceptible. Por el contrario, estos resultados tienen importancia en Medicina Forense o en estudios de Anatomía Patológica, ya que la conservación de los ácidos nucleicos permiten detectar a través de ellos la etiología de una infección vírica que haya podido ocurrir en el paciente, o realizar otros estudios genéticos en el cadáver conservado.
2. Complucad^Ò al 4% durante 1 hora impide la infección por virus cubiertos extracelulares, como el virus de la inmunodeficiencia humana tipo (VIH-1) en el modelo de infección con células mononucleares de sangre periférica (PBMCs). El efecto ha sido corroborado con Virus Herpes simplex tipo 1, en el modelo de replicación in vitro con células Vero y por similitud del proceso infectivo vírico puede hacerse extensivo a otros viriones libres con membrana, como los del virus de la hepatitis C y el virus de la hepatitis B. Estos dos últimos efectos no han sido corroborados experimentalmente por no disponerse de un modelo de cultivo celular habitual para la replicación de estos virus. El efecto inhibidor de la infectividad de VIH-1 es muy importante en Medicina Forense y para la realización de necropsias en Anatomía Patológica por evitar la infección por vía parenteral a través de los líquidos biológicos, que contuviesen virus libres, durante la manipulación de cadáveres que pudiesen estar infectados por algunos de estos virus envueltos.
3. Complucad^Ò al 4% durante 1 hora impide la infección por virus cubiertos intracelulares que puedan transmitirse a través de células infectadas. Este efecto inhibidor ha sido demostrado con el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) utilizando el modelo de infección con células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) infectadas por VIH-1 y cocultivadas con células no infectadas. El efecto ha sido corroborado con Virus Herpes simplex tipo 1, en el modelo de replicación in vitro con células Vero y por similitud del proceso infectivo vírico puede hacerse extensivo a otros viriones intracelulares, como los del virus e Hepatitis C y de Hepatitis B. Estos dos últimos efectos no han sido corroborados experimentalmente por no disponerse de un modelo de cultivo celular habitual para la replicación de estos virus. El efecto inhibidor de la infectividad de VIH-1 es muy importante en Medicina Forense y para la realización de necropsias en Anatomía Patológica por evitar la infección por vía parenteral a través de las células sanguíneas o tisulares durante la manipulación de cadáveres que pudiesen estar infectados por algunos de estos virus.
4. Los resultados obtenidos permiten deducir que Complucad^Ò no afecta a las moléculas proteicas que utilizan los virus para interaccionar con los receptores de las células susceptibles, hecho demostrado con el modelo de Poliovirus 1 si no que alteraría la membrana lipídica de los virus cubiertos (VIH-1 y VHS-1), dónde se encuentran las glicoproteinas de codificación vírica que permiten la interacción con los receptores de las células susceptibles y así la transmisión intercelular de estos virus.

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